858年位於Georgetown的培根學院改名為Kentucky University，遷至Harrodsburg，但不久在南北戰爭中毀於戰火。1865年校園被毀的Kentucky University與財政遇到困難的特蘭西瓦尼亞大學合併，校名仍然為Kentucky Univeristy，校園則遷至特蘭西瓦尼亞大學所在的萊剋星頓。在土地撥贈法案的資助下,（該法案規定每個州可以從聯邦政府得到30000英畝的土地，用於建立教授軍事，工程與農學的學院），肯塔基大學農業和機械學院成立。1869年該學院授予第一個學位，同年詹姆斯·甘迺迪·派特森出任校長。1878年由於指導思想不和，學校分裂，一部分保留Kentucky University的名字,後來改回原名特蘭西瓦尼亞大學，另一部分於1879年改名為肯塔基農業和機械學院，萊剋星頓市為其提供額外資助，並捐贈了52英畝的土地（現在肯塔基大學校園的中心部分），即今肯塔基大學的前身。
1880年學校開設師範學院，開始招收女學生，但女生沒有獲得學位的資格。1888年才第一次授予女性學位。1904年第一座女生宿舍樓Patterson Hall建成，這也是中心校園之外的第一座建築。住在這裏的學生需要穿越一片積水的濕地（即現在的學生活動中心）才能到教室上課。Patterson Hall後被翻新，成為肯塔基大學現存最老的學生宿舍。
1908年學校改名為州立肯塔基大學。1910年擔任四十年校長職務的詹姆斯·派特森退休。1916年學校改名為肯塔基大學。1949年黑人學生Lyman T. Johnson勝訴，得以進入研究生院就讀。1954年起肯塔基大學廢除對學生入學的種族要求。
